Ejemplo de Cromatografía

La Cromatografía es un método frecuentemente utilizado, que permite la separación, identificación y determinación de los componentes químicos en mezclas complejas. Ningún otro método de separación es tan potente y de aplicación tan general como la Cromatografía. Se basa en la velocidad de recorrido que tiene cada uno de los componentes sobre un medio llamado Fase Estacionaria. La Fase Estacionaria está fija en un lugar, ya sea en una columna o en una superficie plana. Al agente que arrastrará consigo a la mezcla de muestra se le llama Fase Móvil, y a la mezcla en sí, Analito, porque es el objeto de análisis.

Como casi ninguna técnica de medida es específica para una sola sustancia química, muchas veces hay que lidiar con las especies extrañas que atenúan o perturban la señal producida por el analito, o producen una señal imposible de distinguir de la del analito. Una sustancia que afecta a una señal analítica o al fondo se llama Interferencia o Interferente.

Las separaciones de los componentes de la mezcla pueden ser completas o parciales. Cuando son Completas, cada componente ocupa una región del espacio bien diferenciada. Y al tratarse de una separación parcial, sólo uno se aparta de la mezcla, dejando a los demás agrupados aún.

Clasificación de los Métodos Cromatográficos

 Los Métodos Cromatográficos son de dos tipos: Cromatografía Plana y Cromatografía en Columna. En la Cromatografía Plana, la Fase Estacionaria está sostenida sobre una placa plana, o en los poros de un papel. La Fase móvil se va a desplazar a través de esta Fase Estacionaria por capilaridad o por efecto de la gravedad.

En la Cromatografía en Columna, la Fase Estacionaria se encuentra contenida en un tubo estrecho, y se fuerza el paso de la fase móvil a lo largo del tubo, a presión o por gravedad.

Métodos  de Cromatografía en Columna

 Las Métodos Cromatográficos en Columna se dividen en tres categorías, dependiendo de la naturaleza de la fase móvil: Gas, Líquido o Fluido Supercrítico.

Cromatografía de Gases (CG)

Método Cromatográfico en que la Fase Móvil es un Gas, es decir, la muestra será desplazada gracias a un Gas, por la Fase Estacionaria. Se clasifica a su vez en dos tipos:

Cromatografía Gas-Líquido (GLC), cuya Fase Estacionaria es un líquido adsorbido o unido a una superficie sólida. El equilibrio que se maneja en la GLC consiste en un Reparto entre el Gas y el líquido. Así es como se comportarán los componentes de la mezcla.

Cromatografía Gas-Sólido, cuya Fase Estacionaria es un Sólido. Se da un equilibrio que consiste en la Adsorción de la Fase móvil en él. Así se separarán los componentes de la mezcla.

Cromatografía Líquida (CL)

Método Cromatográfico en que la Fase Móvil es un Líquido; la muestra estará involucrada en él, y se desplazará por la Fase Estacionaria. Se clasifica en los siguientes cinco tipos:

Cromatografía Líquido-Líquido o reparto, cuya Fase Estacionaria es un Líquido adsorbido o unido a una superficie Sólida. Su equilibrio consiste en el reparto entre líquidos inmiscibles. Así se irá dividiendo la muestra líquida.

Cromatografía Líquido-Sólido o adsorción, donde la Fase Estacionaria es un Sólido, y el fenómeno con el que se va dispersando la muestra es la Adsorción.

Cromatografía Líquida por Intercambio iónico, donde la Fase Estacionaria es una Resina de Intercambio iónico. El intercambio iónico es precisamente la manera en la que la muestra se irá desintegrando para su estudio.

Cromatografía Líquida de Exclusión por tamaño, en la que la Fase Estacionaria es un líquido en los intersticios de un sólido polímero. Su equilibrio consiste en un reparto o en un tamizado.

Cromatografía Líquida de Afinidad, cuya Fase Estacionaria es un Líquido con grupo específico unido a una superficie sólida. Su equilibrio trata de un reparto entre el líquido superficial y el líquido móvil.

Cromatografía de Fluidos Supercríticos (SFC)

Su Fase Estacionaria es una especie orgánica unida a una Superficie Sólida. La manera en que la muestra se repartirá, será entre el Fluido Supercrítico y la Superficie Sólida.

La Elución en Cromatografía de Columna

La Elución es un proceso en el cual los solutos son arrastrados a través de una Fase Estacionaria, por el movimiento de una Fase Móvil. La Fase Móvil que sale de la columna se conoce como Eluato.

Se llama Eluyente a un Disolvente que se usa para transportar los componentes de una mezcla a través de una fase estacionaria.

En la imagen se muestra cómo se resuelven los componentes de una muestra, A y B, mediante Elución, en cinco tiempos en que se va produciendo la separación.

La columna consiste en un tubo de diámetro estrecho, empaquetada con un sólido inerte finamente dividido que contiene la fase estacionaria sobre su superficie. La fase móvil ocupa los espacios abiertos entre las partículas del empaquetamiento.

En un tiempo inicial t₀, una disolución de muestra que contiene la mezcla de A y B en la fase móvil se introduce en la cabeza de la columna como una porción pequeña. Los dos componentes se distribuyen entre la fase móvil y la fase estacionaria. Se va produciendo la elución, forzando a los componentes de la muestra a pasar a través de la columna, mediante la adición continua de nueva fase móvil. Con esta nueva introducción de nueva fase móvil, el Eluyente, la porción de muestra contenida en la fase móvil desciende a lo largo de la columna, donde tienen lugar nuevos repartos entre la fase móvil y la fase estacionaria (tiempo t₁). El reparto entre la nueva fase móvil y la fase estacionaria tiene lugar simultáneamente en el sitio original de la muestra.

La adición de más disolvente hace que las moléculas de soluto desciendan por la columna en una serie continua de transferencias entre las dos fases. Como el movimiento del soluto sólo puede ocurrir en la fase móvil, la velocidad media a la que un soluto se mueve depende de la fracción de tiempo que pase en la fase móvil.

Esta fracción de tiempo es pequeña para los solutos que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria, y grande cuando la retención en la fase móvil es más probable. En el caso ideal, las diferencias resultantes en la velocidad hacen que los componentes de una mezcla se separen en zonas, o bandas, a lo largo de la columna.

El aislamiento de la especie separada se consigue haciendo pasar a través de la columna una cantidad suficiente de fase móvil para que las bandas individuales lleguen al extremo final, donde pueden ser recogidas o detectadas (t₃ y t₄).

Cromatogramas

 Si en el extremo final de la columna, durante la elución, se coloca un detector que responde a la concentración de soluto, y se representa gráficamente su señal en función del tiempo (o del volumen de la fase móvil añadida), se obtiene una serie de picos, como en la figura anterior. Este diagrama se conoce como Cromatograma.

Este diagrama es útil, tanto para el Análisis Cualitativo como el Cuantitativo. El orden de los picos sobre el eje horizontal puede utilizarse para identificar los componentes de la muestra. Las áreas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de cada especie en la mezcla.